BAB II
PEMBAHASAN
Sebegitu jauh pembicaraan kita tentang pewarisan sifat pada eukariot selalu dikaitkan dengan gen-gen yang terletak di dalam kromosom/nukleus. Kenyataannya gen-gen kromosomal ini memang memegang peranan utama di dalam pewarisan sebagian besar sifat genetik. Meskipun demikian, sesekali pernah pula dilaporkan bahwa ada sejumlah sifat genetik yang pewarisannya diatur oleh unsur-unsur di luar nukleus. Pewarisan ekstranukleus, atau dikenal pula sebagai pewarisan sitoplasmik, ini tidak mengikuti pola Mendel. Pewarisan sifat sitoplasmik diatur oleh materi genetik yang terdapat di dalam organel-organel seperti mitokondria, kloroplas (pada tumbuhan), dan beberapa komponen sitoplasmik lainnya. Begitu juga virus dan partikel mirip bakteri dapat bertindak sebagai pembawa sifat herediter sitoplasmik.
Organel Sitoplasmik Pembawa Materi Genetik
Di dalam sitoplasma antara lain terdapat organel-organel seperti mitokondria dan kloroplas, yang memiliki molekul DNA (lihat Bab IX) dan dapat melakukan replikasi subseluler sendiri. Oleh karena itu, kedua organel ini sering kali disebut sebagai organel otonom. Beberapa hasil penelitian memberikan petunjuk bahwa mitokondria dan kloroplas pada awalnya masing-masing merupakan bakteri dan alga yang hidup bebas. Dalam kurun waktu yang sangat panjang mereka kemudian membangun simbiosis turun-temurun dengan sel inang eukariotnya dan akhirnya berkembang menjadi organel yang menetap di dalam sel.
Mitokondria, yang dijumpai pada semua jenis organisme eukariot, diduga membawa hingga lebih kurang 50 gen di dalam molekul DNAnya. Gen-gen ini di antaranya bertanggung jawab atas struktur mitokondria itu sendiri dan juga pengaturan berbagai bentuk metabolisme energi. Enzim-enzim untuk keperluan respirasi sel dan produksi energi terdapat di dalam mitokondria. Begitu juga bahan makanan akan dioksidasi di dalam organel ini untuk menghasilkan senyawa adenosin trifosfat (ATP), yang merupakan bahan bakar bagi berbagai reaksi biokomia.
Sementara itu, kloroplas sebagai organel fotosintetik pada tumbuhan dan beberapa mikroorganisme membawa sejumlah materi genetik yang diperlukan bagi struktur dan fungsinya dalam melaksanakan proses fotosintesis. Klorofil beserta kelengkapan untuk sintesisnya telah dirakit ketika kloroplas masih dalam bentuk alga yang hidup bebas. Pada alga hijau plastida diduga membawa mekanisme genetik lainnya, misalnya mekanisme ketahanan terhadap antibiotik streptomisin pada Chlamydomonas, yang nanti akan dibicarakan pada bagian lain bab ini.
1. Kriteria Pewarisan Sitoplasmik
Sebenarnya tidak ada kriteria yang dapat berlaku universal untuk membedakan pewarisan sitoplasmik dengan pewarisan gen-gen kromosomal. Namun, setidak-tidaknya lima hal di bawah ini dapat digunakan untuk keperluan tersebut.
1. Perbedaan hasil perkawinan resiprok merupakan penyimpangan dari pola Mendel. Sebagai contoh, hasil persilangan antara betina A dan jantan B tidak sama dengan hasil persilangan antara betina B dan jantan A. Jika dalam hal ini pengaruh rangkai kelamin dikesampingkan, maka perbedaan hasil perkawinan resiprok tersebut menunjukkan bahwa salah satu tetua (biasanya betina) memberikan pengaruh lebih besar daripada pengaruh tetua lainnya dalam pewarisan suatu sifat tertentu.
2. Sel kelamin betina biasanya membawa sitoplasma dan organel sitoplasmik dalam jumlah lebih besar daripada sel kelamin jantan. Organel dan simbion di dalam sitoplasma dimungkinkan untuk diisolasi dan dianalisis untuk mendukung pembuktian tentang adanya transmisi maternal dalam pewarisan sifat. Jika materi sitoplasmik terbukti berkaitan dengan pewarisan sifat tertentu, maka dapat dipastikan bahwa pewarisan sifat tersebut merupakan pewarisan sitoplasmik.
3. Gen-gen kromosomal menempati loki tertentu dengan jarak satu sama lain yang tertentu pula sehingga dapat membentuk kelompok berangkai. Oleh karena itu, jika ada suatu materi penentu sifat tidak dapat dipetakan ke dalam kelompok-kelompok berangkai yang ada, sangat dimungkinkan bahwa materi genetik tersebut terdapat di dalam sitoplasma
4. Tidak adanya nisbah segregasi Mendel menunjukkan bahwa pewarisan sifat tidak diatur oleh gen-gen kromosomal tetapi oleh materi sitoplasmik.
5. Substitusi nukleus dapat memperjelas pengaruh relatif nukleus dan sitoplasma. Jika pewarisan suatu sifat berlangsung tanpa adanya pewarisan gen-gen kromosomal, maka pewarisan tersebut terjadi karena pengaruh materi sitoplasmik.
Substitusi nukleus dapat memperjelas pengaruh relatif nukleus dan sitoplasma. Jika pewarisan suatu sifat berlangsung tanpa adanya pewarisan gen-gen kromosomal, maka pewarisan tersebut terjadi karena pengaruh materi sitoplasmik.
2. Materi Genetik diluar Kromosom
Pada sel di samping terdapat gen kromosom, mungkin pula terdapat gen di luar kromosom atau gen nonkromosom. Pada beberapa hal gen nonkromosom dapat berbentuk benda asing seperti sigma dan kappa, sedangkan pada hal lain dapat berupa bagian dari sitoplasma, misalnya plastid. Keduanya terdapat di luar inti sel, yaitu pada sitoplasma, dan tersusun dari bahan DNA, yang dapat berduplikasi dan mutasi. Pewarisan melalui sitoplasma ini mempunyai beberapa pola, antara lain adanya pengaruh maternal. Pada pola ini fenotip turunan ditentukan tidak oleh genotipnya sendiri, melainkan oleh genotip yang dimiliki induk betina, melalui sel telur. Pola yang lain ialah bahwa sifat genetika diturunkan/diwariskan tidak oleh gen kromosom, tetapi oleh gen nonkromosom yang telah dipengaruhi oleh gen kromosom.
2.1. Plasmid
2.1.1. Sifat plasmid
Plasmid adalah molekul DNA berbentuk sirkuler yang terdapat di dalam sel bakteri atau ragi. Plasmid merupakan DNA nonkromosom, karena sel tersebut memiliki kromosom tersendiri. Jadi selain kromosom, di dalam sel bakteri terdapat pula plasmid. Plasmid adalah elemen genetik yang bereplikasi secara bebas dari kromosom hospes. Hampir semua plasmid yang sudah dikenal adalah DNA pita ganda (double stranded DNA). Sebagian besar plasmid sirkular (melingkar). Secara alamiah, plasmid mempunyai berbagai ukuran mulai dari 1-1000 kilo bp. Plasmid khusus adalah suatu molekul DNA double stranded sirkular yang berukuran kurang dari 1/20 ukuran kromosom. Sebagian besar DNA plasmid diisolasi dari sel dalam konfigurasi supercoil yang berbentuk padat dalam sel. Putusnya satu (nick) dari dua pita menyebabkan supercoil berubah menjadi bentuk sirkular terbuka, selanjutnya terjadi putusnya kedua pita pada tempat yang sama. Sehingga terbentuk suatu struktur rangkap linier.
Plasmid memiliki sifat sifat antara lain :
a. Merupakan molekul DNA yang mengandung gen tertentu, ukuranya kira kira 1/ 1000 kali kromosom (DNA) bakteri.
b. Dapat memperbanyak diri melalui proses replikasi. Dengan demikian terjadi pengklonaan DNA yang menghasilkan plasmid dalam jumlah banyak. Satu sel dapat berisi banyak plasmid.
c. Plasmid dapat berpindah ke sel bakteri lain. Perpindahan plasmid dapat dipercepat dengan member ion CsCl (sesium klorida). Dengan demikian plasmid dapat dikeluarkan dan dimasukan ke dalam sel bakteri atau ragi.
d. Sifat bakteri pada keturunan sama dengan induknya, karena plasmid terikat dengan kromosaom inti.
Karena sifat sifat itulah, plsmid digunakan sebagai vektor, yaitu alat untuk memasukan gen ke dalam sel target. Bahkan dengan teknologi khusus para pakar dapat membuat plasmid yang lengkap dengan peta gen yang dikandunganya, contoh: pBR 322, R-plasmid.
2.1.2. Jenis-jenis Plasmid
Salah satu cara pengelompokan plasmid adalah dengan kemampuan mereka untuk ditransfer ke bakteri lain. Conjugative plasmid mengandung apa yang disebut tra-gen, yang melakukan proses kompleks konjugasi, transfer plasmid ke bakteri lain (Gambar 4).
Non-conjugative plasmid tidak mampu memulai konjugasi, maka mereka hanya dapat dipindahkan dengan bantuan conjugative plasmid
Cara lain untuk mengklasifikasikan plasmid adalah dengan fungsi. Ada lima kelas utama:
• Kesuburan-F-plasmid, yang berisi tra-gen. Mereka mampu konjugasi (transfer materi genetik antara bakteri yang menyentuh).
• Perlawanan-(R) plasmid, yang mengandung gen yang dapat membangun perlawanan terhadap antibiotik atau racun dan membantu menghasilkan pili bakteri. Sejarah dikenal sebagai R-faktor, sebelum sifat plasmid dipahami.
• Col-plasmid, yang mengandung gen yang kode untuk (menentukan produksi) bacteriocins, protein yang dapat membunuh bakteri lain.
• Degradatif plasmid, yang memungkinkan pencernaan zat-zat yang tidak biasa, misalnya, toluene atau asam salisilat.
• Plasmid virulensi, yang mengubah bakteri menjadi patogen (yang menyebabkan penyakit).
Plasmid dapat dikelompokkan pada lebih dari satu kelompok fungsional ini.
Berdasarkan jumlah kopi yang dimiliki plasmid
1. Low copy-number → 1 -2 kopi/sel
2. High copy-number → lebih dari 500 kopi/sel
Berdasarkan penghambatan replikasi
1. Relaxed plasmid *→ replikasi DNA plasmid tidak dihambat walaupun replikasi DNA kromosom sel inang dihambat
2. Stringent plasmid → jika replikasi DNA sel inang dihambat maka replikasi pada plasmidnya juga akan dihambat
Berdasarkan bentukunya
1. Covalently closed circles (DNA ccc), bentuk sirkuler untai ganda utuh
2. Open circles (DNA oc), DNA sirkuler untai ganda dengan satu rantai yang utuh, disukai karena mudah untuk diamplifikasi serta mudah diisolasi dan manipulasi.
Dengan jelas plasmid-plasmid membawa gen yang menjamin replikasinya. Untuk beberapa plasmid yang kita tahu sangat kecil, apakah mereka membawa gen-gen lain. Ini disebut cryptic plasmid (plasmid tidak jelas) yang ditemukan melalui pengujian seperti pengujian ekstrak sel menggunakan elektroforesis gel. Beberapa plasmid, juga membawa gen yang perlu untuk konjugasi dan mereka kadang-kadang ddeteksi secara biologi, baik melalui fungsi transfer atau melalui sensitifitas terhadap virus tertentu. Meskipun plasmid tidak membawa gen yang penting untuk hospes dibawah semua kondisi, adanya plasmid dalam sel sangat mempengaruhi fenotif sel. Plasmid dapat membawa macam-macam gen. Gen-gen yang mereka bawa tidak mengganggu, baik dengan replikasi plasmid itu sendiri atau dengan pertahanan hidup hospes.
2.2. Vektor
Ada dua jenis integrasi plasmid ke dalam bakteri inang: Non-integrasi plasmid meniru seperti contoh di atas, sedangkan episomes, contoh yang lebih rendah, mengintegrasikan ke dalam host kromosom.
Plasmid yang digunakan dalam rekayasa genetika disebut vektor. Plasmid berfungsi sebagai alat penting dalam genetika dan bioteknologi laboratorium, di mana mereka biasanya digunakan untuk mengalikan (membuat banyak salinan) atau mengekspresikan gen tertentu. [2] Banyak plasmid tersedia secara komersial untuk penggunaan semacam itu. Gen dapat direplikasi dimasukkan ke dalam salinan plasmid yang mengandung gen yang membuat sel-sel resisten terhadap antibiotik tertentu dan beberapa situs kloning (MCS, atau polylinker), yang merupakan daerah pendek yang biasa digunakan mengandung beberapa pembatasan situs-situs yang mudah memungkinkan penyisipan DNA fragmen di lokasi ini. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam plasmid bakteri oleh suatu proses yang disebut transformasi. Kemudian, bakteri yang terkena antibiotik tertentu. Hanya bakteri yang mengambil salinan plasmid bertahan hidup, karena plasmid membuat mereka tahan. Secara khusus, melindungi gen dinyatakan (digunakan untuk membuat protein) dan protein yang dinyatakan rusak antibiotik. Dengan cara ini antibiotik yang bertindak sebagai filter untuk memilih hanya yang diubah bakteri. Sekarang bakteri ini dapat tumbuh dalam jumlah besar, dipanen dan lysed (sering menggunakan lisis alkali metode) untuk mengisolasi plasmid bunga.
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:
1. mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya,
2. mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,
3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan
4. mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.
2.3. Isolasi DNA plasmid
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.
2.4. Transfer Plasmid
Transfer plasmid melibatkan langkah-langkah sebagai berikut:
1. Pilus seks yang disandi plasmid berinteraksi dengan reseptor pada permukaan sel resipien.
2. Terangsang oleh kontak itu, pilus menarik diri ke dalam sel donor, dengan menarik resipien ke dalam kontak yang erat. Terbentuklah suatu jembatan konjugasi antara kedua sel dan melalui jembatan itu DNA ditransfer.
3. Tergerak pula oleh proses ini adalah sintesis nuklease yang disandi gen tra, yang membelah satu benang DNA plasmid pada suatu tempat yang khas yang disebut asal transfer.
4. Ujung 5’ bebas benang plasmid yang dilekukan kemudian dijulurkan melalui jembatan konjugasi.
5. Biasanya disalin oleh DNA polimerase sel inang, dengan menghasilkan salinan melingkar benang ganda dalam kedua sel.
3. Rekombinasi DNA
Telah diketahui bhwa semua organisme mengandung DNA dari bahan yang sama, yaitu gula, asam fosfat, dan basa N. DNA dapat disambungkan dengan DNA lain dari organisme yang berbeda. Proses penyambungan DNA itu disebut rekombinasi DNA. Sebenarnya tujuanya adalah untuk menyambungkan gen yang ada di dalam DNA. Oleh karean itu rekombinasi DNA disebut jua rekombinasi gen.
Dalam rekombinasi DNA dilakukan pemotongan DNA. Proses pemotongan dan penyambungan itu menggunakan enzim pemotong dan enzim penyambung. Hasil sambunagn disebut rekombinan. Enzim pemotong disebut enzim retriksi endonuklease. Secara alami, enzim ini dikeluarkan oleh bakteri untuk memutuskan DNA virus yang tersambung pada DNA bakteri tanpa merusak DNA bakteri.
Secara alami rekombinasi DNA bias terjadi. Misalnya jika terjadi proses pindah silang pada meiosis, akan terjadi tukar menukar kromatid pada kromosam yang homolog sehingga DNA terputus dan tersambung secara silang. Para pakar pun kemudain mencoba menyambung nyambungkan DNA secara in vitro dari sumber yang berbeda. Alsan dilakukanya rekombinasi adalah :
a. Semua DNA mempunyai struktur yang sama, yakni tersusun atas gula pentosa, asam fosfat, dan basa nitrogen.
b. Kerena strukturnya sama, maka DNA dari sumber mana pun dan dari spesies mana pun dapat di sambung sambungkan.
c. Para pakar telah berhasil mengisolasi atau mensintesis enzim.
d. Gen dapat mengeksprasikan diri atau mengontrol sintesis polipeptida di mana pun berda, asalkan dalam kondisi yang sesuai ; misalnya gen manusia dapat mengekspresikan diri meskipun berada di dalam sel bakteri.
Secara alami rekombinasi DNA bias terjadi. Misalnya jika terjadi proses pindah silang pada meiosis, akan terjadi tukar menukar kromatid pada kromosam yang homolog sehingga DNA terputus dan tersambung secara silang. Para pakar pun kemudain mencoba menyambung nyambungkan DNA secara in vitro dari sumber yang berbeda. Alsan dilakukanya rekombinasi adalah :
a. Semua DNA mempunyai struktur yang sama, yakni tersusun atas gula pentosa, asam fosfat, dan basa nitrogen.
b. Kerena strukturnya sama, maka DNA dari sumber mana pun dan dari spesies mana pun dapat di sambung sambungkan.
c. Para pakar telah berhasil mengisolasi atau mensintesis enzim.
d. Gen dapat mengeksprasikan diri atau mengontrol sintesis polipeptida di mana pun berda, asalkan dalam kondisi yang sesuai ; misalnya gen manusia dapat mengekspresikan diri meskipun berada di dalam sel bakteri.
3.1. Komponen yang diperlukan dalam Rekombinasi DNA.
Untuk mamahami rekombinasi DNA, berturut turut akan kita pelajari tentang gen, enzim pemotong, enzim penyambung, pembawa gen ( vector ), sel target, metode kultur untuk menyeteksi hasil, dan pengklonaan sel yang mengandung DNA rekombinan.
1. Enzim Pemotong dan Penyambung.
Enzim pemotong dikenal sebagai retriksi atau enzim penggunting. Fungsi enzim ini memotong motong benang DNA yang panjang menjadi pendek agar dapat disambung sambungkan lagi. Enzim pemotong secara lami dimiliki oleh sel untuk memotong DNA di dalam sel. Enzim pemotong itu jumlahnya banyak. Setiap enzim bekarja secara khusus. Artinya setiap enzim hanya dapat memotong urutan basa tertentu pada DNA. Dan hasil potonganya berupa sepenggal DNA berujung runcing yang komplemen yang di kenal sebagai DNA ujung runcing.
Selain enzim pemotong retriksi endonuklease, yang terdapat pula enzum penyambung yang berfungsi menyambung nyambungkan DNA, yaitu enzim ligase.Enzim ligase DNA mengkatalisis ikatan fosfodiester antar dua rantai DNA. Ligase DNA tidak dapat menyambungkan DNA untai tunggal, melainkan harus DNA rangkap.
2. Pembawa gen atau Vektor
Mengingat ukuran gen yang sangat kecil, maka memasukan gen ke dalam sel target harus menggunakan pembawa gen atau vector. Vektor itu bertugas sebagai kendaraan bagi gen untuk mengangkut gen masuk ke dalam sel target. Secara alami bakteri plasmid, yaitu DNA sirkuler yang ukuranya 1/ 1000 komosom (DNA) bakteri, dan dapat keluar masuk sel bakteri. Akibatnya bakteri lain tadi mendapatkan sifat baru yang berasal dari bakteri pertama. Peristiwa ini dikenal dengan transformasi.
Plasmid disambung dengan gen terlebih dahulu sehingga terbentuk DNA hasil sambungan yang disebut sebagai chimera (kimera) atau DNA rekombinan. Selanjutnya kimera dimasukan ke dalam sel target yaitu sel bakteri. Sel target akan mendapatkan sifat baru sesuai denagn gen yang diterimanya. Oleh karena itu kimera tersebut berupa DNA, maka sesuai dengan sifatnya, kimera akan mengadakan replikasi di dalam sel inangnya sehingga jumlahnya bertambah banyak. Dengan demikian berlangsunglah proses pengklonan DNA. Ketika kimera melakukan repilkasi, gen yang membawanya akakn ikut tereplikasi sehingga terjadilah pengklonan gen.
3. Sel Target
Sel target yang hisa digunakan dalam rekombinasi DNA adalah sel bakteri Escherichia coli. Alasanya karena :
a. E. coli mudah diperoleh dan mudah dipelihara.
b. Tidak mengandung gen yang membahayakan (tidak ganas)
c. Dapat membelah diri setiap 20 menit sekali sehingga dapat diperoleh keturunan dalam jumlah besar dalam waktu singkat.
3.2. Proses Rekombinasi DNA
Sel ael bakteri yang mengandung plasmid dihancurkan kemudian diambil DNA-nya. Melalui proses sentrifugasi, plasmid dipisahkan dari kromosom bakteri. Plasmid yang masih berbentuk sirkuler diputus oleh enzim retriksi endonuklease pada basa nitrogen GAATTS, sehingga terbentuklah plasmid berbentuk linier yang memiliki ujung basa nitrogen bebas GAATTS. Plasmid ini dapat ditempeli dengan DNA asing yang ujungnya juga memiliki basa nitrogen bebas AATTS sehingga terbentuk plasmid sirkuler baru dengan tambahan DNA asing. Enzim yang berperan dalam penggabungan DNA plasmid dengan DNA asing adalah ligase. Plasmid yang mengandung DNA asing dapat dimasukan ke dalam bakteri. Jadi, sekarang bakteri ini mengandung DNA asing tersebut. Bakteri ini di klona sehingga bakteri turunanya mengandung DNA asing.
Contoh rekombinasi DNA yaitu rekombinasi gen insulin. Gen insulin pada manusia di pulau Lngerhans di ambil, kemdian disambungkan ke dalam plasmid bakteri, membentuk kimera (DNA rekombinan). Kimera itu dimasukan ke dalam sel target E. coli. Bakteri E. coli ini di kultur untuk dikembangbiakank. Bakteri yang biasa hidup di kolon itu ternyata mampu menghasilkan hormone insulin manusia. Hormon insulin tersebut dipanen untuk digunakan oleh yang memerlikannys. Sekali terbentuk bakteri rekombinan penghasil insulin manusia, selamanya akan dapat dipanen insulin untuk pengobatan.
Tidak hanya insulin manusia yang berhasil di produksi melalui rekombinasi DNA, melainkan juga hormone petumbuhan manusia. Para pakar berhasil mencakokan gen hormone pertumbuhan manusia ke dalam sel bakteri dan akhirnya bakteri itulah yang memproduksi hormon pertumbuhan manusia. Hormon ini disunyikan ke orang orang yang mengalami kekerdilan akibat kurangnyaproduksi hormone pertumbuhan di tubuhnya.
4. Kloning DNA
Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA. Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.
4.1. Kloning DNA dalam plasmid vektor
DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli.
Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:
1. Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.
2. Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi
3. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
• Proses dimana plasmid digunakan untuk mengimpor DNA rekombinan ke sel inang untuk kloning.
• Banyak penyakit yang disebabkan oleh perubahan gen. Pemahaman kita tentang penyakit genetik sangat meningkat melalui informasi yang diperoleh dari DNA kloning. Dalam DNA kloning, fragmen DNA yang mengandung gen dari bunga dimasukkan ke dalam vektor kloning atau plasmid.
• Plasmid yang membawa gen untuk resistensi antibiotik, dan sebuah rantai DNA, yang mengandung gen yang diinginkan, keduanya adalah sama dipotong dengan restriksi endonuklease. Plasmid adalah membuka dan gen dibebaskan dari untai DNA induk. Mereka telah saling melengkapi "lengket berakhir." Plasmid yang terbuka dan membebaskan gen dicampur dengan DNA ligase, yang kedua potongan reformasi sebagai DNA rekombinan.
Plasmid dan salinan dari fragmen DNA menghasilkan jumlah DNA rekombinan.
• Rebusan DNA rekombinan ini diperkenankan untuk mengubah budaya bakteri, yang kemudian terkena antibiotik. Semua sel kecuali mereka yang telah dikodekan oleh DNA plasmid rekombinan tewas, meninggalkan kultur sel yang mengandung DNA rekombinan yang diinginkan.
• Kloning DNA memungkinkan salinan setiap bagian tertentu dari DNA (atau RNA) urutan yang akan dipilih di antara banyak orang lain dan diproduksi dalam jumlah terbatas. eknik ini adalah tahap pertama dari sebagian besar percobaan rekayasa genetika: produksi perpustakaan DNA, PCR, DNA sequencing, et al.
Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri. Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.
Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 7).
Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi
Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik. E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium. Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).
Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning
Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda. Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 8).
Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.
‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9). Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA).
Gambar 7.Kloning DNA dalam plasmid vektor
Gambar 8.Pembentukan DNA library
Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vector.
Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library
Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang diinginkan. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization.
cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang, sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library, membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing. Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane. Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi yang sama dengan sel. Filter selajutnya diinkubasi dengan probe.
4.2. PCR (polymerase chain reaction)
PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan enzim Taq polimerase. PCR digunakan untuk mengamplifikasi bagian DNA yang pendek (sampai 10 kb). Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, teknik ini telah melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat bervariasi. Protokol dasar PCR adalah:
I. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga membentuj DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan.
II. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada temperature rendah. Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target.
III. Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim DNA polymerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru.
IV. Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus berulang.
Gambar 10 menunjukkan proses PCR. Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uv-transiluminator.
Gambar 9.Pembentukan cDNA
Gambar 10.Proses PCR
