Sistem Imun

A.Pengertian
Sistem imun adalah serangkaian molekul, sel dan organ yang bekerja sama dalam mempertahankan tubuh dari serangan luar yang dapat mengakibatkan penyakit, seperti bakteri, jamur dan virus. Kesehatan tubuh bergantung pada kemampuan sistem imun untuk mengenali dan menghancurkankan serangan ini.
Jika sistem kekebalan bekerja dengan benar, sistem ini akan melindungi tubuh terhadap infeksi bakteri dan virus, serta menghancurkan sel kanker dan zat asing lain dalam tubuh. Jika sistem kekebalan melemah, kemampuannya melindungi tubuh juga berkurang, sehingga menyebabkan patogen, termasuk virus yang menyebabkan demam dan flu, dapat berkembang dalam tubuh. Sistem kekebalan juga memberikan pengawasan terhadap sel tumor, dan terhambatnya sistem ini juga telah dilaporkan meningkatkan resiko terkena beberapa jenis kanker

B. Fungsi Sistem Imun
Sistem imun memiliki beberapa fungsi bagi tubuh, yaitu sebagai:
a. Penangkal benda asing yang masuk ke dalam tubuh
b. Melindungi tubuh dari invasi penyebab penyakit menghancurkan & menghilangkan mikroorganisme atau substansi asing (bakteri, parasit, jamur, dan virus, serta tumor) yang masuk ke dalam tubuh


Bakteri dan parasit

c. Untuk keseimbangan fungsi tubuh terutama menjaga keseimbangan komponen tubuh yang telah tua
d. Sebagai pendeteksi adanya sel-sel abnormal, termutasi atau ganas, serta menghancurkannya.
e. Menghilangkan jaringan atau sel yg mati atau rusak untuk perbaikan jaringan.
f. Mengenali dan menghilangkan sel yang abnormal Sasaran utama: bakteri patogen & virus Leukosit merupakan sel imun utama (disamping sel plasma, makrofag, & sel mast)
Sistem imun menyediakan kekebalan terhadap suatu penyakit yang disebut imunitas. Respon imun adalah suatu cara yang dilakukan tubuh untuk memberi respon terhadap masuknya patogen atau antigen tertentu ke dalam tubuh.
Respon Imun :
1. Deteksi & mengenali benda asing
2. Komunikasi dgn sel lain untuk berespons
3. Rekruitmen bantuan & koordinasi respons
4. Destruksi atau supresi penginvasi
C. Bagian Sistem Imun
Sistem pertahanan tubuh terbagi atas 2 bagian yaitu:
a. Pertahanan non spesifik, merupakan garis pertahan pertama terhadap masuknya serangan dari luar. Pertahanan non spesifik terbagi atas 3 bagian yaitu :
a. Pertahanan fisik : kulit, mukosa membran
b. Pertahanan kimiawi: saliva,air mata, lisozim (enzim penghancur)
c. Pertahanan biologis: sel darah putih yang bersifat fagosit (neutrofil,monosit,acidofil),protein antimikroba dan respon pembengkakan(inflammatory)
PROSES PERTAHANAN NON SPESIFIK TAHAP PERTAMA
Proses pertahanan tahap pertama ini bisa juga disebut kekebalan tubuh alami. Tubuh memberikan perlawanan atau penghalang bagi masuknya patogen/antigen. Kulit menjadi penghalan bagi masuknya patogen karena lapisan luar kulit mengandung keratin dan sedikit air sehingga pertumbuhan mikroorganisme terhambat. Air mata memberikan perlawanan terhadap senyawa asing dengan cara mencuci dan melarutkan mikroorganisme tersebut. Minyak yang dihasilkan oleh Glandula Sebaceae mempunyai aksi antimikrobial. Mukus atau lendir digunakan untuk memerangkap patogen yang masuk ke dalam hidung atau bronkus dan akan dikeluarkjan oleh paru-paru. Rambut hidung juga memiliki pengaruh karenan bertugas menyaring udara dari partikel-partikel berbahaya. Semua zat cair yang dihasilkan oleh tubuh (air mata, mukus, saliva) mengandung enzimm yang disebut lisozim. Lisozim adalah enzim yang dapat meng-hidrolisis membran dinding sel bakteri atau patogen lainnya sehingga sel kemudian pecah dan mati. Bila patogen berhasil melewati pertahan tahap pertama, maka pertahanan kedia akan aktif.
b. Pertahanan spesifik, dilakukan oleh sel darah putih yaitu sel darah putih Limfosit. Disebut spesifik karena: dilakukan hanya oleh sel darah putih Limfosir, membentuk kekebalan tubuh, dipicu oleh antigen (senyawa asing) sehingga terjadi pembentukan antibodi dan setiap antibodi spesifik untuk antigen tertentu. Limfosit berperan dalam imunitas yang diperantarai sel dan antibodi.
PROSES PERTAHANAN NON SPESIFIK TAHAP KEDUA
Inflamasi merupakan salah satu proses pertahanan non spesifik, dimana jika ada patogen atau antigen yang masuk ke dalam tubuh dan menyerang suatu sel, maka sel yang rusak itu akan melepaskan signal kimiawi yaitu histamin. Signal kimiawi berdampak pada dilatasi (pelebaran) pembuluh darah dan akhirnya pecah. Sel darah putih jenis neutrofil,acidofil dan monosit keluar dari pembuluh darah akibat gerak yang dipicu oleh senyawa kimia(kemokinesis dan kemotaksis). Karena sifatnya fagosit,sel-sel darah putih ini akan langsung memakan sel-sel asing tersebut. Peristiwa ini disebut fagositosis karena memakan benda padat, jika yang dimakan adalah benda cair, maka disebut pinositosis. Makrofag atau monosit bekerja membunuh patogen dengan cara menyelubungi patogen tersebut dengan pseudopodianya dan membunuh patogen dengan bantuan lisosom. Pembunuh dengan bantuan lisosom bisa melalui 2 cara yaitu lisosom menghasilkan senyawa racun bagi si patogen atau lisosom menghasilkan enzim lisosomal yang mencerna bagian tubuh mikroba. Pada bagian tubuh tertentu terdapat makrofag yang tidak berpindah-pindah ke bagian tubuh lain, antara lain : paru-paru (alveolar macrophage), hati (sel-sel Kupffer), ginjal (sel-sel mesangial), otak (sel–sel microgial), jaringan penghubung (histiocyte) dan pada nodus dan spleen. Acidofil/Eosinofil berperan dalam menghadapi parasit-parasit besar. Sel ini akan menempatkan diri pada dinding luar parasit dan melepaskan enzim penghancur dari granul-granul sitoplasma yang dimiliki. Selain leukosit, protein antimikroba juga berperan dalam menghancurkan patogen. Protein antimikroba yang paling penting dalam darah dan jaringan adalah protein dari sistem komplemen yang berperan penting dalam proses pertahan non spesifik dan spesifik serta interferon. Interferon dihasilkan oleh sel-sel yang terinfeksi oleh virus yang berfungsi menghambat produksi virus pada sel-sel tetangga. Bila patogen berhasil melewati seluruh pertahanan non spesifik, maka patogen tersebut akan segera berhadapan dengan pertahanan spesifik yang diperantarai oleh limfosit.

Sistem pertahanan tubuh

JENIS-JENIS ANTIBODI
Imunoglobulin (Ig)
Ada 5 kelas:
1. Ig M ® berperan sbg reseptor permukaan sel B & disekresi pd tahap awal respons sel plasma
2. Ig G ® Ig terbanyak di darah, diproduksi jika tubuh berespons thd antigen yg sama
Ig M & IgG berperan jika tjd invasi bakteri & virus serta aktivasi komplemen
3. Ig E ® melindungi tubuh dr infeksi parasit & mrp mediator pd reaksi alergi; melepaskan histamin dari basofil & sel mast
4. Ig A ® ditemukan pd sekresi sistem perncernaan, pernapasan, & perkemihan (cth: pd airmata & ASI)
5. Ig D ® terdapat pada banyak permukaan sel B; mengenali antigen pd sel B
Antibodi adalah protein berbentuk Y dan disebut Immunoglobulin(Ig), hanya dibuat oleh Limfosit B. Antibodi berikatan dengan antigen pada akhir lengan huruf Y. Bentuk lengan ini akan menentukkan beberapa macam IG yang ada, yaitu IgM, IgG, IgA,IgE dan IgD. Saat respon imun humoral, IgM adalah antibodi yang pertama kali muncul. Jenis lainya akan muncul beberapa hari kemudian. Limfosit B akan membuat Ig yang sesuai saat interleukin dikeluarkan untuk mengaktifkan Limfosit T saat antigen menyerang.
Antibodi juga dapat menghentikan aktivitas antigen yang merusak dengan cara mengikatkan antibodi pada antigen dan menjauhkan antigen tersebut dari sel yang ingin dirusak. Proses ini dinamakan neuralisasi. Semua Ig mempunyai kemampuan ini. Antibodi juga mempersiapkan antigen untuk dimakan oleh makrofag. Antobodi mengikatkan diri pada antigen sehingga permukaannya menjadi lebih mudah menempel pada makrofag. Proses ini disebut opsonisasi.
IgM dan IgG memicu sistem komplemen, suatu kelompok protein yang mempunyai kemampuan unutk memecah membran sel. IgM dan IgG bekerja paling maksimal dalam sistem sirkulasi,IgA dapat keluar dari peredaran darah dan memasuki cairan tubuh lainnya. IgA berperan penting untuk menghindarkan infeksi pada permukaan mukosa. IgA juga berperan dalam resistensi terhadap banyak penyakit. IgA dapat ditemukan pada ASI dan membantu pertahanan tubuh bayi.IgD merupakan antibodi yang muncul untuk dilibatkan dalam inisiasi respon imun. IgE merupakan antibodi yang terlibat dalam reaksi alergi dan kemungkinan besar merespon infeksi dari protozoa dan parasit.
Antibodi tidak menghancurkan antigen secara langsung, akan tetapi menetralkannya atau menyebabkan antigen ini menjadi target bagi proses penghancutan oleh mekanisme opsonosasi, aglutinasi,presipitasi atau fiksasi komplemen. Opsonisasi, aglutinasi dan presipitasi meningkatkan proses fagositosis dari komplek antigen-antibodi sementara fiksasi komplemen memicu proses lisis dati protein komplemen pada bakteri atau virus.

Fungsi antibodi

D. Kerja Sistem Imun
Kerja dari sistem imun dibagi menjadi:
1. Innate immunity, atau sering disebut imunitas alamiah, merupakan mekanisme pertama yang akan terjadi saat infeksi berlangsung, terjadi secara cepat terhadap infeksi mikrobia, dan terjadi antara jam ke-0 sampai jam ke-12 infeksi. Mekanisme tersebut melibatkan :
 penghalang fisik dan kimiawi, seperti epitel dan senyawa antimikrobia yang dihasilkan oleh sel epitel,
 Sel fagosit (neutrofil dan maktofag) dan sel natural killer
 protein darah, termasuk sistem komplemen dan mediator inflamasi lainnya, da
 protein sitokin yang mengatur sel-sel pada mekanisme ini. Innate immunity terjadi karena tubuh dapat mengenali struktur mikroba yang masuk, bisa karena sebelumnya mikroba tersebut sudah pernah menginfeksi tubuh, atau karena struktur mikroba tersebut mirip seperti struktur mikroba lain yang pernah menginfeksi tubuh. Kelemahan dari mekanisme ini adalah tidak dapat mengenali struktur yang sama sekali baru menginfeksi tubuh. Untuk infeksi tersebut, adaptive immunity yang berperan.
2. Adaptive immunity, atau imunitas spesifik, terjadi ketika innate immunity gagal menghalau infeksi karena benda asing yang masuk memiliki struktur yang sama sekali baru bagi tubuh. Mekanisme ini terjadi sekitar 1 hingga 5 hari setelah infeksi. Secara singkat, makanisme ini akan mencoba membuat "ingatan" baru tentang struktur benda asing yang masuk ke tubuh, kemudia bereaksi untuk menghalau benda asing tersebut. Sel yang terlibat pada mekanisme ini adalah limfosit, baik sel T limfosit maupun sel B limfosit. Adaptive immunity sendiri terbagi menjadi 2, yaitu:
a. Imunitas humoral, yaitu imunitas yang dimediasi oleh molekul di dalam darah, yang disebut antibodi. Antibodi dihasilkan oleh sel B limfosit. Mekanisme imunitas ini ditujukan untuk benda asing yang berada di di luar sel (berada di cairan atau jaringan tubuh). B limfosit akan mengenali benda asing tersebut, kemudian akan memproduksi antibodi. Antibodi merupakan molekul yang akan menempel di suatu molekul spesifik (antigen) di permukaan benda asing tersebut. Kemudian antibodi akan menggumpalkan benda asing tersebut sehingga menjadi tidak aktif, atau berperan sebagai sinyal bagi sel-sel fagosit.
b. Imunitas selular, yaitu imunitas yang dimediasi oleh sel T limfosit. Mekanisme ini ditujukan untuk benda asing yang dapat menginfeksi sel (beberapa bakteri dan virus) sehingga tidak dapat dilekati oleh antibodi. T limfosit kemudian akan menginduksi 2 hal: (1) fagositosis benda asing tersebut oleh sel yang terinfeksi, dan (2) lisis sel yang terinfeksi sehingga benda asing tersebut terbebas ke luar sel dan dapat di dilekati oleh antibodi
Selain itu dalam sistem imun juga dikenal:
1. Komplemen (zat glikoprotein yang berperan membantu kerja sel imun yaitu sebagai aktivator, mediator, penghancur)
2. Sitokine/limfokim (zat yang dihasilkan oleh sel sel limfosit dan beberapa sel sistem imun yang mana berperan sebagao motivator dalam sistem imun


Komplemen

E.Komponen dalam sistem imun dan gangguannya
Komponen utama dalam sistem imun selain yang telah disebutkan diatas, adalah sel darah putih. Sistem kekebalan tubuh berkaitan dengan sel darah putih atau leukosit. Berdasarkan adanya bintik-bintik atau granular, Leukosit terbagi atas :
1.Granular, memiliki bintik-bintik. Leukosit granular yaitu Basofil, Acidofil/Eosinofil dan Neutrofil.

Basofil


Eosinofil


Neutrofil.

2.Agranular, tidak memiliki bintik-bintik . Leukosit Agranular yaitu Monosit dan Limfosit.

Monosit


Limfosit

Selain itu, ada juga sel bernama Macrophage (makrofag), yang biasanya berasal dari monosit. Makrofag bersifat fagositosis, menghancurkan sel lain dengan cara memakannya.


Gambar Makrofag

Kemudian, pada semua limfosit dewasa, permukaannya tertempel reseptor antigen yang hanya dapat mengenali satu antigen. Ada juga Sel Pemuncul Antigen (Antigen Presenting Cells). Saat antigen memasuki memasuki sel tubuh, molekul tertentu mengikatkan diri pada antigen dan memunculkannya di hadapan limfosit. Molekul ini dibuat oleh gen yang disebut Major Histocompability Complex(MHC) dan dikenal sebagai molekul MHC. MHC 1 menghadirkan antigen di hadapan Limfosit T pembunuh dan MHC II menghadirkan antigen ke hadapan Limfosit T Pembantu.
Limfosit berperan utama dalam respon imun diperantarai sel. Limfosit terbagi atas 2 jenis yaitu Limfosit B dan Limfosit T. Berikut adalah perbedaan antara Limfosit T dan Limfosit B.

Terdapat 3 jenis sel Limfosit B yaitu :
•Limfosit B plasma, memproduksi antibodi
•Limfosit B pembelah, menghasilkan Limfosit B dalam jumlah banyak dan cepat
•Limfosit B memori, menyimpan mengingat antigen yang pernah masuk ke dalam tubuh Terdapat 3 jenis Limfosit T yaitu:
•Limfosit T pempantu (Helper T cells), berfungsi mengantur sistem imun dan mengontrol kualitas sistem imun
•Limfosit T pembunuh(Killer T cells) atau Limfosit T Sitotoksik, menyerang sel tubuh yang terinfeksi oleh patogen
•Limfosit T surpressor (Surpressor T cells), berfungsi menurunkan dan menghentikan respon imun jika infeksi berhasil diatasi
Gangguan pada sistem kekebalan terjadi :
 ketika tubuh menghasilkan reaksi kekebalan melawan dirinya sendiri (gangguan autoimun).
 ketika tubuh tidak dapat menghasilkan reaksi kekebalan yang tepat melawan serangan mikroorganisme (gangguan imunodefisiensi).
 ketika reaksi kekebalan normal terhadap antigen benda asing merusak jaringan-jaringan normal (reaksi alergi).

MATERI GENETIKA

A. Susunan Kimia Asam Nukleat
Asam nuklat merupakan persenyawaan yang ada pada protoplasma yang fungsinya mensintesis atau mengontrol biosintesis dan membawa informasi genetika.
Asam nukleat merupakan polimer dari nukleotida:
1. Fosfat
2. gula pentosa
3. Basa organic
Asam nukleat terdiri dari 2 tipe, yaitu:
1. Asam deoksiribonukleat (ADN) atau deoxyribonukleat acid (DNA)
2. Asam ribonukleat (ARN) atau ribonucleic acid (RNA)

B. Struktur Kimia DNA dan RNA
1. Struktur DNA
DNA (deoxyribonucleic acid) atau asam deoksiribosa nukleat (ADN) merupakan tempat penyimpanan informasi genetik.
Pada tahun 1953, Frances Crick dan James Watson menemukan model molekul DNA sebagai suatu struktur heliks beruntai ganda, atau yang lebih dikenal dengan heliks ganda Watson-Crick.DNA merupakan makromolekul polinukleotida yang tersusun atas polimer nukleotida yang berulang-ulang, tersusun rangkap, membentuk DNA haliks ganda dan berpilin ke kanan. Setiap nukleotida terdiri dari tiga gugus molekul, yaitu :
- Gula 5 karbon (2-deoksiribosa)
- basa nitrogen yang terdiri golongan purin yaitu adenin (Adenin = A) dan guanin (guanini = G), serta golongan pirimidin, yaitu sitosin (cytosine = C) dan timin (thymine = T) - gugus fosfat
Berikut susunan struktur kimia komponen penyusun DNA:
Baik purin ataupun pirimidin yang berkaitan dengan deoksiribosa membentuk suatu molekul yang dinamakan nukleosida atau deoksiribonukleosida yang merupakan prekursor elementer untuk sintesis DNA. Prekursor merupakan suatu unsur awal pembentukan senyawa deoksiribonukleosida yang berkaitan dengan gugus fosfat.DNA tersusun dari empat jenis monomer nukleotida.
Keempat basa nitrogen nukleotida di dalam DNA tidak berjumlah sama rata. Akan tetapi, pada setiap molekul DNA, jumlah adenin (A) selalu sama dengan jumlah timin (T). Demikian pula jumlah guanin (G) dengan sitisin(C) selalu sama. Fenomena ini dinamakan ketentuan Chargaff. Adenin (A) selalu berpasangan dengan timin (T) dan membentuk dua ikatan hidrogen (A=T), sedagkan sitosin (C) selalu berpasangan dengan guanin (G) dan membentuk 3 ikatan hirogen (C = G).

Stabilitas DNA heliks ganda ditentukan oleh susunan basa dan ikatan hidrogen yang terbentuk sepanjang rantai tersebut.karean perubahan jumlah hidrogen ini, tidak mengehrankan bahwa ikatan C=G memerlukan tenaga yang lebih besar untuk memisahkannya.
DNA merupakan makromolekul yang struktur primernya adalah polinukleotida rantai rangkap berpilin. Sturktur ini diibaratkan sebagai sebuah tangga.Anak tangganya adalah susunan basa nitrogen, dengan ikatan A-T dan G-C. Kedua “tulang punggung tangganya” adalah gula ribosa. Antara mononukleotida satu dengan yang lainnya berhubungan secara kimia melalui ikatan fosfodiester. DNA heliks ganda yang panjangnya juga memiliki suatu polaritas. Polaritas heliks ganda berlawanan orientasi satu sama lain. Kedua rantai polinukleotida DNA yang membentuk heliks ganda berjajar secara antipararel. Jika digambarkan sebagai berikut :

2. Struktur RNA
RNA ( ribonucleic acid ) atau asam ribonukleat merupakan makromolekul yang berfungsi sebagai penyimpan dan penyalur informasi genetic. RNA sebagai penyimpan informasi genetik misalnya pada materi genetik virus, terutama golongan retrovirus.RNA sebagai penyalur informasi genetik misalnya pada proses translasi untuk sintesis protein. RNA juga dapat berfungsi sebagai enzim ( ribozim ) yang dapat mengkalis formasi RNA-nya sendiri atau molekul RNA lain.
RNA merupakan rantai tungga polinukleotida. Setiap ribonukleotida terdiri dari tiga gugus molekul, yaitu :
- 5 karbon
- basa nitrogen yang terdiri dari golongan purin (yang sama dengan DNA) dan golongan pirimidin yang berbeda yaitu sitosin (C) dan Urasil (U)
- gugus fosfat
Purin dan pirimidin yang berkaitan dengan ribosa membentuk suatu molekul yang dinamakan nukleosida atau ribonukleosida, yang merupakan prekursor dasar untuk sintesis DNA. Ribonukleosida yang berkaitan dengan gugus fosfat membentuk suatu nukleotida atau ribonukleotida. RNA merupakan hasil transkripsi dari suatu fragmen DNA, sehingga RNA merupakan polimer yang jauh lebih pendek dibandingkan DNA.

Tipe RNA
RNA terdiri dari tiga tipe, yaitu mRNA ( messenger RNA ) atau RNAd ( RNA duta ), tRNA ( transfer RNA ) atau RNAt ( RNA transfer ), dan rRNA ( ribosomal RNA ) atau RNAr ( RNA ribosomal ):
• RNAd
RNAd merupakan RNA yang urutan basanya komplementer dengan salah satu urutan basa rantai DNA.RNAd membawa pesan atau kode genetik (kodon) dari kromosom (di dalam inti sel) ke ribosom (di sitoplasma).Kode genetik RNAd tersebut kemudian menjadi cetakan utnuk menetukan spesifitas urutan asam amino pada rantai polipeptida.RNAd berupa rantai tunggal yang relatif panjang.
• RNAr
RNAr merupakan komponen struktural yang utama di dalam ribosom.Setiap subunit ribosom terdiri dari 30 – 46% molekul RNAr dan 70 – 80% protein.
• RNAt
RNAt merupakan RNA yang membawa asam amino satu per satu ke ribosom.Pada salah satu ujung RNAt terdapat tiga rangkaian baa pendek ( disebut antikodon ).Suatu asam amino akan melekat pada ujung RNAt yang berseberangan dengan ujung antikodon.Pelekatan ini merupakan cara berfungsinya RNAt, yaitu membawa asam amino spesifik yang nantinya berguna dalam sintesis protein yaitu pengurutan asam amino sesuai urutan kodonnya pada RNAd.
C. Model DNA
1. Anatomi DNA
DNA (deoxyribose nucleic acid) merupakan komponen penyusun kehidupan. Ia terdapat pada semua organisme hidup dari mulai bakteri terkecil sampai ikan paus raksasa. Molekul ini tidak hanya menentukan sifat fisik, seperti warna rambut dan warna mata, tapi juga kemungkinan penyakit yang dimiliki. DNA adalah material pembawa sifat yang dapat ditemukan pada sel. Ia menyediakan instruksi untuk membuat, menjaga, dan mengatur kerja sel dan organisme.
a. Penyusun Utama DNA
Sesuai dengan namanya, DNA, Deoxyribose Nucleic Acid. Penyusun utama DNA adalah gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen (deoksiribose).

Gambar Perbedaan Ribose dan Deoksiribose
Perhatikan gambar di atas, pada deoksiribose, satu atom oksigen pada salah satu atom C ribose hilang.
Tiap pita/rantai double helix terbuat dari unit-unit berulang yang disebut nukleotida. Satu nukleotida terdiri dari tiga gugus fungsi; satu gula ribose, triphosphate, dan satu basa nitrogen.

Gambar Nukleotida
Satu hal yang perlu diingat adalah posisi triphosphate dan basa nitrogen yang terikat pada ribosa. Gugus triphosphat terikat pada atom C no 5′ dari ribosa (Lihat gambar di atas). Gugus triphosphate ini hanya dimiliki oleh nukleotida bebas. Sedangkan nukleotida yang terikat pada rantai DNA kehilangan dua dari gugus phosphate ini, sehingga hanya satu phosphate yang masih tertinggal.
Ketika nukleotida bergabung menjadi DNA, nukleotida-nukleotida tersebut dihubungkan oleh ikatan phosphodiester. Ikatan kovalen yang terjadi antara gugus phosphate pada satu nukleotida, dengan gugus OH pada nukleotida lainnya. Sehingga setiap rantai DNA akan mempunyai ‘backbone’ phosphate-ribosa-phosphate-ribosa-phosphate dan seterusnya.

Gambar Struktur DNA Sederhana
Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa ‘backbone’ DNA akan mempunyai ujung 5′ (dengan phosphate bebas yang terikat), dan ujung 3′ (dengan gugus OH bebas). Pada gambar tersebut, tiap-tiap nukleotida dibuat berbeda warna agar lebih jelas.
b. Basa Nitrogen Pada DNA
Pada struktur DNA, gula ribosa dan gugus phosphate yang terikat adalah sama. Yang berbeda hanyalah pada basa nitrogen. Jadi sebetulnya perbedaan disebabkan oleh variasi susunan dari basa-basa nitrogen yang terdapat pada rantai DNA. Ada empat macam basa nitrogen. Adenin, Cytosine, Guainne, dan Thymine.

Gambar Basa Nitrogen
Ketika basa-basa nitrogen tersebut terikat dalam nukleotida, maka penamaan-pun berubah. Ingat kembali penjelasan di awal tentang nukelotida. Nukleotida terdiri dari gugus triphosphate dan satu basa nitrogen yang terikat pada satu molekul ribose. Nah.. basa-basa nitrogen ini apabila terikat pada ribose membentuk nukleotida maka penamaannya-pun berubah.
Adenin menjadi 2′deoxyadenosine triphosphate, cytosin menjadi 2′deoxycytidine triphosphate, guainne menjadi 2′deoxyguanosine triphosphate, dan Thymine menjadi 2′deoxythymidine triphosphate. Disingkat menjadi A, C, G, dan T.
Perhatikan bahwa ada dua pasang basa yang mirip. A dan G sama-sama mempunyai dua cincin karbon-nitrogen, disebut golongan purine. Sedangkan C dan T hanya mempunyai satu cincin karbon-nitrogen, masuk golongan pirimidin.
c. Penyebab Bentuk DNA Double Helix

Gambar Ikatan Hidrogen Antara Basa-Basa Nitrogen
Interaksi ikatan hidrogen antara masing-masing basa nitrogen menyebabkan bentuk dari dua rantai DNA menjadi sedemikian rupa, bentuk ini disebut double helix. Interaksi spesifik ini terjadi antara basa A dengan T, dan C dengan G. Sehingga jika double helix dibayang kan sebagai sebuah tangga spiral, maka ikatan basa-basa ini sebagai anak tangga-nya. Lebar dari ‘anak tangga’ adalah sama, karena pasangan basa selalu terdiri dari satu primidin dan satu purin.

Gambar Struktur DNA Double Helix lengkap
DNA dapat mengalami kerusakan, biasa disebut mutasi. Zat yang menyebabkan kerusakan pada DNA disebut mutagen, yang akan merubah susunan dan keteraturan dari DNA. Mutagen bisa berupa oksidator kuat, alkylating agen, dan juga radiasi elektromagnetik seperti sinar UV, dan sinar X. Tipe kerusakan tergantung dari jenis mutagen. Makhluk hidup yang mengalami mutasi bisa mengalami kematian dan bisa juga bertahan hidup, yang biasa dikenal dengan istilah mutan.
2. Fleksibilitas Struktur Heliks Ganda DNA
Model struktur fisik molekul DNA pertama kali diajukan pada tahun 1953 oleh J. D Watson dan F. H. C. Crick seperti yang terlihat pada gambar 1. A di bawah ini:

Gambar Struktur double helix DNA
Gambar di atas memiliki beberapa karakteristik seperti memiliki bentuk tangga berpilin (double helix) dengan diameter sebesar 2,37 nm, jarak antara dua pasangan basa berurutan adalah 0,34 nm. Sementara itu, di dalam setiap putaran spiral terdapat 10 pasangan basa sehingga jarak antara dua basa yang tegak lurus di dalam masing-masing rantai adalah 3,4 nm.
Model tangga berpilin ini menggambarkan struktur molekul DNA sebagai dua rantai polinukleotida yang saling memilin membentuk spiral dengan arah pilinan ke kanan. Fosfat dan gula pada masing-masing rantai menghadap ke arah luar sumbu pilinan, sedangkan basa nitrogen menghadap ke arah dalam sumbu pilinan dengan susunan yang sangat khas sebagai pasangan-pasangan basa antara kedua rantai membentuk ikatan hidrogen.
DNA yang dominan ditemukan dalam setiap sel hidup berupa DNA dengan tipe B atau yang sesuai dengan model asli Watson dan Crick. Terdapat banyak variasi dari double helix DNA dimana pada tipe variasi tersebut terdapat banyak perbedaan. Di bawah ini terdapat gambar dari bermacam variasi bentuk DNA.

Gambar struktur variasi model DNA(Keterangan gambar : DNA-B (kiri), DNA-A (tengah), DNA-Z (kanan))
Perbedaan konformasi dan ciri-ciri ketiga double helix DNA di atas dapat tersaji dalam tabel di bawah ini:

Bermacam-macam bentuk DNA di atas sifatnya fleksibel, artinya dapat berubah dari satu ke yang lainnya bergantung kepada kondisi lingkungannya.

HORMON

A.Sekresi hormonal
Hormon merupakan mediator kimia yang mengatur aktivitas sel / organ tertentu. Dahulu sekresi hormonal dikenal dengan cara dimana hormon disintesis dalam suatu jaringan diangkut oleh sistem sirkulasi untuk bekerja pada organ lain disebut sebagai fungsi Endokrin (kelenjar). Kelenjar ini merupakan kelenjar yang tidak mempunyai saluran sehingga sekresinya akan masuk aliran darah dan mengikuti peredaran darah ke seluruh tubuh. Apabila sampai pada suatu organ target, maka hormon akan merangsang terjadinya perubahan. Pada umumnya pengaruh hormon berbeda dengan saraf. Perubahan yang dikontrol oleh hormon biasanya merupakan perubahan yang memerlukan waktu panjang. Contohnya pertumbuhan dan pemasakan seksual.

Gbr. Kelenjar-kelenjar endokrin dalam tubuh manusia

Kelenjar-kelenjar yang terdapat dalam tubuh manusia :
a. Kelenjar hipofisis (kelenjar pituitari)
Kelenjar ini terletak pada dasar otak besar dan menghasilkan bermacam-macam hormon yang mengatur kegiatan kelenjar lainnya. Oleh karena itu kelenjar hipofisis disebut master gland. Kelenjar hipofisis dibagi menjadi tiga bagian, yaitu bagian anterior, bagian tengah, dan bagian posterior.
1) Hipofisis lobus anterior
Yaitu menghasilkan:
 Hormone tirotropin (Tiroid stimulating hormone, TSH) berfungsi memelihara pertumbuhan dan perkembangan kelenjar targetnya (tiroid kelenjar gondok) dan merangsang tiroid untuk mensekresikan hormon tiroksin.
 Andrenocorticotrophic (corticotropia, ACTH) berfungsi memelihara pertumbuhan dan perkembangan normal korteks adrenal dan merangsang untuk mengsekresikan kortisol dan glucocorticoid yang lain.
 Gonadotropin, yang terdiri dari Follicle stimulating hormone (FSH) dan Luteinizing hormone (LH)
 Somatotropic hormone (Ghowth hormone, GH) yaitu hormon yang menyebabkan pertumbuhan dari semua jaringan tubuh yang dapat tumbuh.
 Prolaktin (Luteotropic hormone, LTH) berfungsi untuk merangsang sekresi kelenjar susu (glandula mamae)
b) Hipofisis lobus intermedia yaitu hormon perangsang melanosit atau melanosit Stimulating Hormon MSH). Apabila hormon ini banyak dihasilkan maka menyebabkan kulit menjadi hitam.
c) Hipofisis lobus posterior, yaitu hormon yang dihasilkan :
 Hormone vasopressin atau antidiuretik hormone (ADH) yaitu berfungsi untuk mencegah pembentukan urine dalam jumlah banyak dan berpengaruh dalam pengaturan tekanan darah.
 Hormon oksitosin yang berfungsi merangsang kontraksi yang kuat pada uterus sehingga penting dalam membantu proses kelahiran

b. Kelenjar Tiroid
Kelenjar tiroid ialah organ endokrin yang terletak di leher manusia. Fungsinya ialah mengeluarkan hormon tiroid. Antara hormon yang terpenting ialah Thyroxine (T4) dan Triiodothyronine (T3). Hormon-hormon ini mengawal metabolisma (pengeluaran tenaga) manusia.
Kelenjar tiroid terdiri dari dua lobus, satu di sebelah kanan dan satu lagi di sebelah kiri. Keduanya dihubungkan oleh suatu struktur (yang dinamakan) isthmus atau ismus. Setiap lobus berbentuk seperti buah pir. Kelenjar tiroid mempunyai satu lapisan kapsul yang tipis dan pretracheal fascia. Pada keadaan tertentu kelenjar tiroid aksesoria dapat ditemui di sepanjang jalur perkembangan embriologi tiroid.
Struktur ismus atau isthmus yang dalam bahasa latin artinya penyempitan, merupakan struktur yang menghubungkan lobus kiri dan kanan. Posisinya kira-kira setinggi cincin trakea 2-3 dan berukuran sekitar 1,25 cm. Anastomosis di antara kedua arteri thyroidea superior terjadi di sisi atas ismus, sedangkan cabang-cabang vena thyroidea inferior ber-anastomosis di bawahnya. Pada sebagian orang dapat ditemui lobus tambahan berupa lobus piramidal yang menjulur dari ismus ke bawah.
Darah ke kelenjar tiroid dibekalkan oleh arteri superior thyroid yang merupakan cabang pertama arteri external carotid(ECA). Arteri ini menembusi pretracheal fascia sebelum sampai ke bahagian superior pole lobe kelenjar tiroid. Saraf laryngeal terletak berhampiran(di belakang) arteri ini, jadi jika dalam pembedahan tiroidektomi, kemungkinan besar saraf ini terpotong jika tidak berhati-hati.
Kelenjar tiroid juga dibekalkan oleh arteri inferior thyroid yang merupakan cabang daripada thyrocervical trunk(cabang daripada arteri subclavian). Dalam 3% populasi manusia, terdapat satu lagi arteri ke kelenjar tiroid, iaitu arteri thyroid ima.
Sel tiroid adalah satu-satunya sel dalam tubuh manusia yang dapat menyerap iodin atau yodium yang diambil melalui pencernaan makanan. Iodin ini akan bergabung dengan asam amino tirosin yang kemudian akan diubah menjadi T3 (triiodotironin) dan T4 (triiodotiroksin). Dalam keadaan normal pengeluaran T4 sekitar 80% dan T3 15%.
Sedangkan yang 5% adalah hormon-hormon lain seperti T2.
T3 dan T4 membantu sel mengubah oksigen dan kalori menjadi tenaga (ATP = adenosin tri fosfat). T3 bersifat lebih aktif daripada T4. T4 yang tidak aktif itu diubah menjadi T3 oleh enzim 5-deiodinase yang ada di dalam hati dan ginjal. Proses ini juga berlaku di organ-organ lain seperti hipotalamus yang berada di otak tengah.
Hormon-hormon lain yang berkaitan dengan fungsi tiroid ialah TRH (tiroid releasing hormon)dan TSH (tiroid stimulating hormon). Hormon-hormon ini membentuk satu sistem aksis otak (hipotalamus dan pituitari)- kelenjar tiroid. TRH dikeluarkan oleh hipotalamus yang kemudian merangsang kelenjar pituitari mengeluarkan TSH. TSH yang dihasilkan akan merangasang tiroid untuk mengeluarkan T3 dan T4. Oleh karena itu hal yang mengganggu jalur diats akan mentyebabkan produksi T3 dan T4.
c. Kelenjar langerhans (pancreas)
Pulau langerhans mempunyai sel-sel alfa dan beta.
a) Sel-sel alfa menghasilkan glukogon yang berfungsi meningkatkan kadar gula dalam darah.
b) Sel-sel beta menghasilkan hormon insulin yang berfungsi mengubah gula darah menjadi gula otot (menurunkan gula darah).
c) Selain itu pancreas juga menghasilkan kelenjar pencernaan.
d. Kelenjar paratiroid
Kelenjar ini menghasilkan hormon paratormon (PTH), yang terletak menempel pada permukaan kelenjar tiroid dan berjumlah 4 buah.
Hormon paratormon (PTH) berperan dalam metabolisme kalsium dan fosfot di dalam darah. Kekurangan hormone paratiroid dapat mengakibatkan gejala kekejangan otot.
e. Kelenjar anak ginjal (kelenjar adrenal, suprarenalis)
Kelenjar anak ginjal terletak menempel di atas ginjal, yang terdiri atas 2 bagian, yaitu :
a) Bagian korteks
Menghasilkan hormon deoksikortison dan kortison. Kekurangan hormon ini dapat menimbulkan penyakit Addison yang dapat mengakibatkan kematian.

b) Bagian medula
Menghasilkan adrenalin (epinefrin). Hormon ini berfungsi untuk mengubah gula otot (glikogen) menjadi gula darah (glukosa), menyempitkan pembuluh darah sehingga menaikkan tekanan darah bersama dengan hormon insulin, adrenalin mengatur kadar gula darah sampai 0,1%.
f. Kelenjar kelamin
a) Kelenjar kelamin pria (testis)
Testis mempunyai 2 fungsi utama menghasilkan sel-sel mani (sperma) oleh tubulus seminifelus dan sekresi hormon jantan (antrogen) yaitu hormon testosteron oleh sel-sel leyding.
Hormon testosteron berfungsi untuk mempengaruhi spermatogenesis (pembentukan sperma) dan menimbulkan sifat-sifat seks sekunder pada pria seperti suara yang besar, tumbuh cambang, dan lain-lain
b) Kelenjar kelamin wanita (ovarium)
Ovarium dapat menghasilkan ovum (sel telur) dan hormone-hormon ekstrogen dan progesteron.
Estrogen berpengaruh pada :
Pematangan sel-sel kelamin, pertumbuhan alat kelamin, pemeliharaan sistem reproduksi, menimbulkan tanda-tanda seks sekunder pada wanita.
Progesteron dihasilkan oleh korpus leuteun yaitu badan kuning di dalam ovarium. Progesteron berfungsi mempengaruhi kontraksi otot rahim. Pada endometrium uterus berfungsi mempersiapkan untuk nidasi bloktostocyst dan mempercepat pertumbuhan kelenjar pada endonetrium uterus.

B. Mekanisme kerja hormon
 Ekstraseluler
Konsentasi hormon dalam cairan ekstraseluler sangat rendah, yaitu berkisar antara 10-15–10-9. Sel target harus membedakan antara berbagai hormon dengan konsentrasi yang kecil, juga antar hormon dengan molekul lain. Derajad pembeda dilakukan oleh molekul pengenal yang terikat pada sel target disebut Reseptor. Reseptor Hormon adalah molekul pengenal spesifik dari sel tempat hormon berikatan sebelum memulai efek biologiknya.
Setiap reseptor hormon mempunyai sedikitnya dua daerah domain fungsional yaitu :
a. Domain pengenal akan mengikat hormon
b. Regio skunder menghasilkan (tranduksi) signal yang merangkaikan pengaturan beberapa fungsi intraseluler.
Umumnya pengikatan Hormon Reseptor ini bersifat reversibel dan nonkovalen, bisa terdapat pada permukaan sel (membran plasma) atau pun intraselluler. Interaksi hormon dengan reseptor permukaan sel akan memberikan sinyal pembentukan senyawa yang disebut sebagai second messenger (hormon sendiri dianggap sebagai first messenger). Jika hormon sudah berinteraksi dengan reseptor spesifiknya pada sel-sel target, maka peristiwa-peristiwa komunikasi intraseluler dimulai. Hal ini dapat melibatkan reaksi modifikasi seperti fosforilasi dan dapat mempunyai pengaruh pada ekspresi gen dan kadar ion. Peristiwa-peristiwa ini hanya memerlukan dilepaskannya zat-zat pengatur.

Gbr. Jenis reseptor berbagai membran dengan contohnya masing-masing.

cAMP merupakan second messenger yang dibentuk dari senyawa ATP oleh kerja enzim Adenilat Siklase dengan adanya Mg2+ yang membentuk suatu kompleks dengan ATP untuk bertindak sebagai substrat untuk reaksi.
Mg2+
ATP cAMP + PPi + H+

cAMP mempunyai peranan yang sangat menentukan dalam proses kerja sejumlah hormon. Epineprin meningkatkan kadar cAMP yang tinggi di dalam sel-sel otot dan perubahan yang relatif kecil dalam sel-sel hati .
Sistem Adenilat siklase
Enzim Adenilat Siklase berada pada permukaan internal membran plasma mengkatalisasi pembentukan cAMP dari ATP.
Aktifitas enzim Adenilat Siklase ↑ jumlah cAMP↑.
Pengaturan aktivasi dan inaktivasi enzim Adenilat siklase oleh hormon berlangsung dengan pengantara :
• Reseptor spesifik hormon pada permukaan luar membran plasma (Rs atau Ri)
• Paling sedikit 2 protein pengatur nukleotida guanosin (protein G) yang tergantung GTP. Protein pengatur ini diberi simbol Gs(stimulasi) dan Gi(inhibisi) yang masing-masing tersusun tiga subunit α,β,χ .Subunit β dan χ dalam Gs identik dengan dalam Gi, sedangkan subunit α dalam Gs berbeda dengan dalam Gi diberi tanda αs dan αi.
Pengikatan sebuah hormon dengan reseptor meningkatkan interaksi reseptor dengan kompleks perangsang Gs .Dengan pengantaraan reseptor berlangsung pengikatan GTP yang tergantung pada Mg2+ oleh α dan disosiasi sekaligus β dan χ dari α. Subunit α dapat juga merupakan ADP ter-ribosilasi sebagai respon terhadap toksin Kolera yang mengaktivasinya. Dalam menimbulkan proses tersebut akan membuat inaktif enzim GTPase, dengan demikian αs dibekukan dalam bentuk aktif. Toksin Pertusis dapat memblokir inaktivasi dari adenilat siklase melalui aktivitas ribosiltransferase-ADP pada subunit αi.

Gbr. komplek  & , Subunit G. , , Inhibits G 


Gbr. Sistem Adenilat siklase

 Intraseluler
Kelompok hormon yang memiliki reseptor intraseluler bersifat lipofilik dan dapat berdifusi lewat membran plasma semua sel, tetapi hanya menjumpai reseptor spesifiknya di dalam sel sasaran. Kompleks Hormon Reseptor selanjutnya menjalani reaksi aktivasi yang tergantung pada suhu serta garam dan reaksi ini akan mengakibatkan perubahan ukuran, bentuk, muatan permukaan yang membuat kompleks hormon tersebut mampu berikatan dengan kromatin pada inti sel. Kompleks hormon reseptor berikatan pada suatu regio spesifik DNA yang dinamakan unsur respon hormon/HRE dan membuat aktif dan inaktif gen spesifik.Dengan memberi pengaruh yang selektif pada transkripsi gen dan produksi masing-masing mRNA, pembentukan protein spesifik dan proses metabolik dipengaruhi.

Gbr. Reseptor Hormon Intraseleluler
Contoh kasus yang sama terjadi pada hormon Thyroid.
Kelenjar thyroid merupakan organ yang mensekresikan terutama hormon 3,5,3’-l-triiodotironin ( T3) dan 3,5,3’,5’-l- tetraiodotironin (T4). Hormon ini membutuhkan Iodium untuk aktifitas biologiknya. Pada kelenjar Thyroid T3 dan T4 terikat pada thyroglobulin, tempat berlangsungnya biosintesa hormon ini . Pembebasan T3 dan T4 dari thyroglobulin memerlukan enzim proteolitik yang distimulasi oleh TSH (atau cAMP) tetapi dihambat oleh Iodium dan oleh Litium seperti Litium Karbonat yang digunakan untuk terapi manik depresif. Efek ini dimanfaatkan dengan penggunaan Kalium Iodida untuk terapi hiperthyroidisme.
T3 dan T4 yang berada di sirkulasi berikatan dengan protein darah yaitu :
- TBG ( 85 % )
- TBPA
- Albumin (sedikit )
Aktifitas biologik hormon ini adalah oleh fraksi yang tidak terikat (bebas)
Hormon T3 dan T4 berikatan dengan reseptor spesifiknya dengan afinitas yang tinggi di nukleus sel sasaran. Di sitoplasma hormon ini berikatan pada tempat dengan afinitas yang rendah dengan reseptor spesifiknya. Kompleks hormon reseptor berikatan pada suatu regio spesifik DNA, menginduksi atau merepresi sintesis protein dengan meningkatkan atau menurunkan transkripsi gen.
Dari transkripsi gen–gen ini timbul perubahan dari tingkat transkripsi m RNA mereka. Perubahan tingkat mRNA ini mengubah tingkatan dari produk protein dari gen ini.Protein ini kemudian memperantarai respon hormon Thyroid. Hormon Thyroid dikenal sebagai modulator tumbuh kembang → penting pada usia balita.

Pewarisan Sifat Melalui Sitoplasma

BAB II
PEMBAHASAN

Sebegitu jauh pembicaraan kita tentang pewarisan sifat pada eukariot selalu dikaitkan dengan gen-gen yang terletak di dalam kromosom/nukleus. Kenyataannya gen-gen kromosomal ini memang memegang peranan utama di dalam pewarisan sebagian besar sifat genetik. Meskipun demikian, sesekali pernah pula dilaporkan bahwa ada sejumlah sifat genetik yang pewarisannya diatur oleh unsur-unsur di luar nukleus. Pewarisan ekstranukleus, atau dikenal pula sebagai pewarisan sitoplasmik, ini tidak mengikuti pola Mendel. Pewarisan sifat sitoplasmik diatur oleh materi genetik yang terdapat di dalam organel-organel seperti mitokondria, kloroplas (pada tumbuhan), dan beberapa komponen sitoplasmik lainnya. Begitu juga virus dan partikel mirip bakteri dapat bertindak sebagai pembawa sifat herediter sitoplasmik.

Organel Sitoplasmik Pembawa Materi Genetik
Di dalam sitoplasma antara lain terdapat organel-organel seperti mitokondria dan kloroplas, yang memiliki molekul DNA (lihat Bab IX) dan dapat melakukan replikasi subseluler sendiri. Oleh karena itu, kedua organel ini sering kali disebut sebagai organel otonom. Beberapa hasil penelitian memberikan petunjuk bahwa mitokondria dan kloroplas pada awalnya masing-masing merupakan bakteri dan alga yang hidup bebas. Dalam kurun waktu yang sangat panjang mereka kemudian membangun simbiosis turun-temurun dengan sel inang eukariotnya dan akhirnya berkembang menjadi organel yang menetap di dalam sel.
Mitokondria, yang dijumpai pada semua jenis organisme eukariot, diduga membawa hingga lebih kurang 50 gen di dalam molekul DNAnya. Gen-gen ini di antaranya bertanggung jawab atas struktur mitokondria itu sendiri dan juga pengaturan berbagai bentuk metabolisme energi. Enzim-enzim untuk keperluan respirasi sel dan produksi energi terdapat di dalam mitokondria. Begitu juga bahan makanan akan dioksidasi di dalam organel ini untuk menghasilkan senyawa adenosin trifosfat (ATP), yang merupakan bahan bakar bagi berbagai reaksi biokomia.
Sementara itu, kloroplas sebagai organel fotosintetik pada tumbuhan dan beberapa mikroorganisme membawa sejumlah materi genetik yang diperlukan bagi struktur dan fungsinya dalam melaksanakan proses fotosintesis. Klorofil beserta kelengkapan untuk sintesisnya telah dirakit ketika kloroplas masih dalam bentuk alga yang hidup bebas. Pada alga hijau plastida diduga membawa mekanisme genetik lainnya, misalnya mekanisme ketahanan terhadap antibiotik streptomisin pada Chlamydomonas, yang nanti akan dibicarakan pada bagian lain bab ini.
1. Kriteria Pewarisan Sitoplasmik
Sebenarnya tidak ada kriteria yang dapat berlaku universal untuk membedakan pewarisan sitoplasmik dengan pewarisan gen-gen kromosomal. Namun, setidak-tidaknya lima hal di bawah ini dapat digunakan untuk keperluan tersebut.
1. Perbedaan hasil perkawinan resiprok merupakan penyimpangan dari pola Mendel. Sebagai contoh, hasil persilangan antara betina A dan jantan B tidak sama dengan hasil persilangan antara betina B dan jantan A. Jika dalam hal ini pengaruh rangkai kelamin dikesampingkan, maka perbedaan hasil perkawinan resiprok tersebut menunjukkan bahwa salah satu tetua (biasanya betina) memberikan pengaruh lebih besar daripada pengaruh tetua lainnya dalam pewarisan suatu sifat tertentu.
2. Sel kelamin betina biasanya membawa sitoplasma dan organel sitoplasmik dalam jumlah lebih besar daripada sel kelamin jantan. Organel dan simbion di dalam sitoplasma dimungkinkan untuk diisolasi dan dianalisis untuk mendukung pembuktian tentang adanya transmisi maternal dalam pewarisan sifat. Jika materi sitoplasmik terbukti berkaitan dengan pewarisan sifat tertentu, maka dapat dipastikan bahwa pewarisan sifat tersebut merupakan pewarisan sitoplasmik.
3. Gen-gen kromosomal menempati loki tertentu dengan jarak satu sama lain yang tertentu pula sehingga dapat membentuk kelompok berangkai. Oleh karena itu, jika ada suatu materi penentu sifat tidak dapat dipetakan ke dalam kelompok-kelompok berangkai yang ada, sangat dimungkinkan bahwa materi genetik tersebut terdapat di dalam sitoplasma
4. Tidak adanya nisbah segregasi Mendel menunjukkan bahwa pewarisan sifat tidak diatur oleh gen-gen kromosomal tetapi oleh materi sitoplasmik.
5. Substitusi nukleus dapat memperjelas pengaruh relatif nukleus dan sitoplasma. Jika pewarisan suatu sifat berlangsung tanpa adanya pewarisan gen-gen kromosomal, maka pewarisan tersebut terjadi karena pengaruh materi sitoplasmik.
Substitusi nukleus dapat memperjelas pengaruh relatif nukleus dan sitoplasma. Jika pewarisan suatu sifat berlangsung tanpa adanya pewarisan gen-gen kromosomal, maka pewarisan tersebut terjadi karena pengaruh materi sitoplasmik.
2. Materi Genetik diluar Kromosom
Pada sel di samping terdapat gen kromosom, mungkin pula terdapat gen di luar kromosom atau gen nonkromosom. Pada beberapa hal gen nonkromosom dapat berbentuk benda asing seperti sigma dan kappa, sedangkan pada hal lain dapat berupa bagian dari sitoplasma, misalnya plastid. Keduanya terdapat di luar inti sel, yaitu pada sitoplasma, dan tersusun dari bahan DNA, yang dapat berduplikasi dan mutasi. Pewarisan melalui sitoplasma ini mempunyai beberapa pola, antara lain adanya pengaruh maternal. Pada pola ini fenotip turunan ditentukan tidak oleh genotipnya sendiri, melainkan oleh genotip yang dimiliki induk betina, melalui sel telur. Pola yang lain ialah bahwa sifat genetika diturunkan/diwariskan tidak oleh gen kromosom, tetapi oleh gen nonkromosom yang telah dipengaruhi oleh gen kromosom.

2.1. Plasmid
2.1.1. Sifat plasmid
Plasmid adalah molekul DNA berbentuk sirkuler yang terdapat di dalam sel bakteri atau ragi. Plasmid merupakan DNA nonkromosom, karena sel tersebut memiliki kromosom tersendiri. Jadi selain kromosom, di dalam sel bakteri terdapat pula plasmid. Plasmid adalah elemen genetik yang bereplikasi secara bebas dari kromosom hospes. Hampir semua plasmid yang sudah dikenal adalah DNA pita ganda (double stranded DNA). Sebagian besar plasmid sirkular (melingkar). Secara alamiah, plasmid mempunyai berbagai ukuran mulai dari 1-1000 kilo bp. Plasmid khusus adalah suatu molekul DNA double stranded sirkular yang berukuran kurang dari 1/20 ukuran kromosom. Sebagian besar DNA plasmid diisolasi dari sel dalam konfigurasi supercoil yang berbentuk padat dalam sel. Putusnya satu (nick) dari dua pita menyebabkan supercoil berubah menjadi bentuk sirkular terbuka, selanjutnya terjadi putusnya kedua pita pada tempat yang sama. Sehingga terbentuk suatu struktur rangkap linier.


Plasmid memiliki sifat sifat antara lain :
a. Merupakan molekul DNA yang mengandung gen tertentu, ukuranya kira kira 1/ 1000 kali kromosom (DNA) bakteri.
b. Dapat memperbanyak diri melalui proses replikasi. Dengan demikian terjadi pengklonaan DNA yang menghasilkan plasmid dalam jumlah banyak. Satu sel dapat berisi banyak plasmid.
c. Plasmid dapat berpindah ke sel bakteri lain. Perpindahan plasmid dapat dipercepat dengan member ion CsCl (sesium klorida). Dengan demikian plasmid dapat dikeluarkan dan dimasukan ke dalam sel bakteri atau ragi.
d. Sifat bakteri pada keturunan sama dengan induknya, karena plasmid terikat dengan kromosaom inti.

Karena sifat sifat itulah, plsmid digunakan sebagai vektor, yaitu alat untuk memasukan gen ke dalam sel target. Bahkan dengan teknologi khusus para pakar dapat membuat plasmid yang lengkap dengan peta gen yang dikandunganya, contoh: pBR 322, R-plasmid.


2.1.2. Jenis-jenis Plasmid
Salah satu cara pengelompokan plasmid adalah dengan kemampuan mereka untuk ditransfer ke bakteri lain. Conjugative plasmid mengandung apa yang disebut tra-gen, yang melakukan proses kompleks konjugasi, transfer plasmid ke bakteri lain (Gambar 4).


Non-conjugative plasmid tidak mampu memulai konjugasi, maka mereka hanya dapat dipindahkan dengan bantuan conjugative plasmid
Cara lain untuk mengklasifikasikan plasmid adalah dengan fungsi. Ada lima kelas utama:
• Kesuburan-F-plasmid, yang berisi tra-gen. Mereka mampu konjugasi (transfer materi genetik antara bakteri yang menyentuh).
• Perlawanan-(R) plasmid, yang mengandung gen yang dapat membangun perlawanan terhadap antibiotik atau racun dan membantu menghasilkan pili bakteri. Sejarah dikenal sebagai R-faktor, sebelum sifat plasmid dipahami.
• Col-plasmid, yang mengandung gen yang kode untuk (menentukan produksi) bacteriocins, protein yang dapat membunuh bakteri lain.
• Degradatif plasmid, yang memungkinkan pencernaan zat-zat yang tidak biasa, misalnya, toluene atau asam salisilat.
• Plasmid virulensi, yang mengubah bakteri menjadi patogen (yang menyebabkan penyakit).
Plasmid dapat dikelompokkan pada lebih dari satu kelompok fungsional ini.
 Berdasarkan jumlah kopi yang dimiliki plasmid
1. Low copy-number → 1 -2 kopi/sel
2. High copy-number → lebih dari 500 kopi/sel
 Berdasarkan penghambatan replikasi
1. Relaxed plasmid *→ replikasi DNA plasmid tidak dihambat walaupun replikasi DNA kromosom sel inang dihambat
2. Stringent plasmid → jika replikasi DNA sel inang dihambat maka replikasi pada plasmidnya juga akan dihambat
 Berdasarkan bentukunya
1. Covalently closed circles (DNA ccc), bentuk sirkuler untai ganda utuh
2. Open circles (DNA oc), DNA sirkuler untai ganda dengan satu rantai yang utuh, disukai karena mudah untuk diamplifikasi serta mudah diisolasi dan manipulasi.
Dengan jelas plasmid-plasmid membawa gen yang menjamin replikasinya. Untuk beberapa plasmid yang kita tahu sangat kecil, apakah mereka membawa gen-gen lain. Ini disebut cryptic plasmid (plasmid tidak jelas) yang ditemukan melalui pengujian seperti pengujian ekstrak sel menggunakan elektroforesis gel. Beberapa plasmid, juga membawa gen yang perlu untuk konjugasi dan mereka kadang-kadang ddeteksi secara biologi, baik melalui fungsi transfer atau melalui sensitifitas terhadap virus tertentu. Meskipun plasmid tidak membawa gen yang penting untuk hospes dibawah semua kondisi, adanya plasmid dalam sel sangat mempengaruhi fenotif sel. Plasmid dapat membawa macam-macam gen. Gen-gen yang mereka bawa tidak mengganggu, baik dengan replikasi plasmid itu sendiri atau dengan pertahanan hidup hospes.

2.2. Vektor


Ada dua jenis integrasi plasmid ke dalam bakteri inang: Non-integrasi plasmid meniru seperti contoh di atas, sedangkan episomes, contoh yang lebih rendah, mengintegrasikan ke dalam host kromosom.
Plasmid yang digunakan dalam rekayasa genetika disebut vektor. Plasmid berfungsi sebagai alat penting dalam genetika dan bioteknologi laboratorium, di mana mereka biasanya digunakan untuk mengalikan (membuat banyak salinan) atau mengekspresikan gen tertentu. [2] Banyak plasmid tersedia secara komersial untuk penggunaan semacam itu. Gen dapat direplikasi dimasukkan ke dalam salinan plasmid yang mengandung gen yang membuat sel-sel resisten terhadap antibiotik tertentu dan beberapa situs kloning (MCS, atau polylinker), yang merupakan daerah pendek yang biasa digunakan mengandung beberapa pembatasan situs-situs yang mudah memungkinkan penyisipan DNA fragmen di lokasi ini. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam plasmid bakteri oleh suatu proses yang disebut transformasi. Kemudian, bakteri yang terkena antibiotik tertentu. Hanya bakteri yang mengambil salinan plasmid bertahan hidup, karena plasmid membuat mereka tahan. Secara khusus, melindungi gen dinyatakan (digunakan untuk membuat protein) dan protein yang dinyatakan rusak antibiotik. Dengan cara ini antibiotik yang bertindak sebagai filter untuk memilih hanya yang diubah bakteri. Sekarang bakteri ini dapat tumbuh dalam jumlah besar, dipanen dan lysed (sering menggunakan lisis alkali metode) untuk mengisolasi plasmid bunga.
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:
1. mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya,
2. mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,
3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan
4. mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.

2.3. Isolasi DNA plasmid
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

2.4. Transfer Plasmid
Transfer plasmid melibatkan langkah-langkah sebagai berikut:
1. Pilus seks yang disandi plasmid berinteraksi dengan reseptor pada permukaan sel resipien.
2. Terangsang oleh kontak itu, pilus menarik diri ke dalam sel donor, dengan menarik resipien ke dalam kontak yang erat. Terbentuklah suatu jembatan konjugasi antara kedua sel dan melalui jembatan itu DNA ditransfer.
3. Tergerak pula oleh proses ini adalah sintesis nuklease yang disandi gen tra, yang membelah satu benang DNA plasmid pada suatu tempat yang khas yang disebut asal transfer.
4. Ujung 5’ bebas benang plasmid yang dilekukan kemudian dijulurkan melalui jembatan konjugasi.
5. Biasanya disalin oleh DNA polimerase sel inang, dengan menghasilkan salinan melingkar benang ganda dalam kedua sel.

3. Rekombinasi DNA
Telah diketahui bhwa semua organisme mengandung DNA dari bahan yang sama, yaitu gula, asam fosfat, dan basa N. DNA dapat disambungkan dengan DNA lain dari organisme yang berbeda. Proses penyambungan DNA itu disebut rekombinasi DNA. Sebenarnya tujuanya adalah untuk menyambungkan gen yang ada di dalam DNA. Oleh karean itu rekombinasi DNA disebut jua rekombinasi gen.
Dalam rekombinasi DNA dilakukan pemotongan DNA. Proses pemotongan dan penyambungan itu menggunakan enzim pemotong dan enzim penyambung. Hasil sambunagn disebut rekombinan. Enzim pemotong disebut enzim retriksi endonuklease. Secara alami, enzim ini dikeluarkan oleh bakteri untuk memutuskan DNA virus yang tersambung pada DNA bakteri tanpa merusak DNA bakteri.
Secara alami rekombinasi DNA bias terjadi. Misalnya jika terjadi proses pindah silang pada meiosis, akan terjadi tukar menukar kromatid pada kromosam yang homolog sehingga DNA terputus dan tersambung secara silang. Para pakar pun kemudain mencoba menyambung nyambungkan DNA secara in vitro dari sumber yang berbeda. Alsan dilakukanya rekombinasi adalah :
a. Semua DNA mempunyai struktur yang sama, yakni tersusun atas gula pentosa, asam fosfat, dan basa nitrogen.
b. Kerena strukturnya sama, maka DNA dari sumber mana pun dan dari spesies mana pun dapat di sambung sambungkan.
c. Para pakar telah berhasil mengisolasi atau mensintesis enzim.
d. Gen dapat mengeksprasikan diri atau mengontrol sintesis polipeptida di mana pun berda, asalkan dalam kondisi yang sesuai ; misalnya gen manusia dapat mengekspresikan diri meskipun berada di dalam sel bakteri.
Secara alami rekombinasi DNA bias terjadi. Misalnya jika terjadi proses pindah silang pada meiosis, akan terjadi tukar menukar kromatid pada kromosam yang homolog sehingga DNA terputus dan tersambung secara silang. Para pakar pun kemudain mencoba menyambung nyambungkan DNA secara in vitro dari sumber yang berbeda. Alsan dilakukanya rekombinasi adalah :
a. Semua DNA mempunyai struktur yang sama, yakni tersusun atas gula pentosa, asam fosfat, dan basa nitrogen.
b. Kerena strukturnya sama, maka DNA dari sumber mana pun dan dari spesies mana pun dapat di sambung sambungkan.
c. Para pakar telah berhasil mengisolasi atau mensintesis enzim.
d. Gen dapat mengeksprasikan diri atau mengontrol sintesis polipeptida di mana pun berda, asalkan dalam kondisi yang sesuai ; misalnya gen manusia dapat mengekspresikan diri meskipun berada di dalam sel bakteri.

3.1. Komponen yang diperlukan dalam Rekombinasi DNA.
Untuk mamahami rekombinasi DNA, berturut turut akan kita pelajari tentang gen, enzim pemotong, enzim penyambung, pembawa gen ( vector ), sel target, metode kultur untuk menyeteksi hasil, dan pengklonaan sel yang mengandung DNA rekombinan.
1. Enzim Pemotong dan Penyambung.
Enzim pemotong dikenal sebagai retriksi atau enzim penggunting. Fungsi enzim ini memotong motong benang DNA yang panjang menjadi pendek agar dapat disambung sambungkan lagi. Enzim pemotong secara lami dimiliki oleh sel untuk memotong DNA di dalam sel. Enzim pemotong itu jumlahnya banyak. Setiap enzim bekarja secara khusus. Artinya setiap enzim hanya dapat memotong urutan basa tertentu pada DNA. Dan hasil potonganya berupa sepenggal DNA berujung runcing yang komplemen yang di kenal sebagai DNA ujung runcing.


Selain enzim pemotong retriksi endonuklease, yang terdapat pula enzum penyambung yang berfungsi menyambung nyambungkan DNA, yaitu enzim ligase.Enzim ligase DNA mengkatalisis ikatan fosfodiester antar dua rantai DNA. Ligase DNA tidak dapat menyambungkan DNA untai tunggal, melainkan harus DNA rangkap.


2. Pembawa gen atau Vektor
Mengingat ukuran gen yang sangat kecil, maka memasukan gen ke dalam sel target harus menggunakan pembawa gen atau vector. Vektor itu bertugas sebagai kendaraan bagi gen untuk mengangkut gen masuk ke dalam sel target. Secara alami bakteri plasmid, yaitu DNA sirkuler yang ukuranya 1/ 1000 komosom (DNA) bakteri, dan dapat keluar masuk sel bakteri. Akibatnya bakteri lain tadi mendapatkan sifat baru yang berasal dari bakteri pertama. Peristiwa ini dikenal dengan transformasi.


Plasmid disambung dengan gen terlebih dahulu sehingga terbentuk DNA hasil sambungan yang disebut sebagai chimera (kimera) atau DNA rekombinan. Selanjutnya kimera dimasukan ke dalam sel target yaitu sel bakteri. Sel target akan mendapatkan sifat baru sesuai denagn gen yang diterimanya. Oleh karena itu kimera tersebut berupa DNA, maka sesuai dengan sifatnya, kimera akan mengadakan replikasi di dalam sel inangnya sehingga jumlahnya bertambah banyak. Dengan demikian berlangsunglah proses pengklonan DNA. Ketika kimera melakukan repilkasi, gen yang membawanya akakn ikut tereplikasi sehingga terjadilah pengklonan gen.
3. Sel Target
Sel target yang hisa digunakan dalam rekombinasi DNA adalah sel bakteri Escherichia coli. Alasanya karena :
a. E. coli mudah diperoleh dan mudah dipelihara.
b. Tidak mengandung gen yang membahayakan (tidak ganas)
c. Dapat membelah diri setiap 20 menit sekali sehingga dapat diperoleh keturunan dalam jumlah besar dalam waktu singkat.
3.2. Proses Rekombinasi DNA
Sel ael bakteri yang mengandung plasmid dihancurkan kemudian diambil DNA-nya. Melalui proses sentrifugasi, plasmid dipisahkan dari kromosom bakteri. Plasmid yang masih berbentuk sirkuler diputus oleh enzim retriksi endonuklease pada basa nitrogen GAATTS, sehingga terbentuklah plasmid berbentuk linier yang memiliki ujung basa nitrogen bebas GAATTS. Plasmid ini dapat ditempeli dengan DNA asing yang ujungnya juga memiliki basa nitrogen bebas AATTS sehingga terbentuk plasmid sirkuler baru dengan tambahan DNA asing. Enzim yang berperan dalam penggabungan DNA plasmid dengan DNA asing adalah ligase. Plasmid yang mengandung DNA asing dapat dimasukan ke dalam bakteri. Jadi, sekarang bakteri ini mengandung DNA asing tersebut. Bakteri ini di klona sehingga bakteri turunanya mengandung DNA asing.
Contoh rekombinasi DNA yaitu rekombinasi gen insulin. Gen insulin pada manusia di pulau Lngerhans di ambil, kemdian disambungkan ke dalam plasmid bakteri, membentuk kimera (DNA rekombinan). Kimera itu dimasukan ke dalam sel target E. coli. Bakteri E. coli ini di kultur untuk dikembangbiakank. Bakteri yang biasa hidup di kolon itu ternyata mampu menghasilkan hormone insulin manusia. Hormon insulin tersebut dipanen untuk digunakan oleh yang memerlikannys. Sekali terbentuk bakteri rekombinan penghasil insulin manusia, selamanya akan dapat dipanen insulin untuk pengobatan.


Tidak hanya insulin manusia yang berhasil di produksi melalui rekombinasi DNA, melainkan juga hormone petumbuhan manusia. Para pakar berhasil mencakokan gen hormone pertumbuhan manusia ke dalam sel bakteri dan akhirnya bakteri itulah yang memproduksi hormon pertumbuhan manusia. Hormon ini disunyikan ke orang orang yang mengalami kekerdilan akibat kurangnyaproduksi hormone pertumbuhan di tubuhnya.
4. Kloning DNA
Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA. Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.



4.1. Kloning DNA dalam plasmid vektor
DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli.
Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:
1. Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.
2. Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi
3. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
• Proses dimana plasmid digunakan untuk mengimpor DNA rekombinan ke sel inang untuk kloning.
• Banyak penyakit yang disebabkan oleh perubahan gen. Pemahaman kita tentang penyakit genetik sangat meningkat melalui informasi yang diperoleh dari DNA kloning. Dalam DNA kloning, fragmen DNA yang mengandung gen dari bunga dimasukkan ke dalam vektor kloning atau plasmid.
• Plasmid yang membawa gen untuk resistensi antibiotik, dan sebuah rantai DNA, yang mengandung gen yang diinginkan, keduanya adalah sama dipotong dengan restriksi endonuklease. Plasmid adalah membuka dan gen dibebaskan dari untai DNA induk. Mereka telah saling melengkapi "lengket berakhir." Plasmid yang terbuka dan membebaskan gen dicampur dengan DNA ligase, yang kedua potongan reformasi sebagai DNA rekombinan.


Plasmid dan salinan dari fragmen DNA menghasilkan jumlah DNA rekombinan.
• Rebusan DNA rekombinan ini diperkenankan untuk mengubah budaya bakteri, yang kemudian terkena antibiotik. Semua sel kecuali mereka yang telah dikodekan oleh DNA plasmid rekombinan tewas, meninggalkan kultur sel yang mengandung DNA rekombinan yang diinginkan.
• Kloning DNA memungkinkan salinan setiap bagian tertentu dari DNA (atau RNA) urutan yang akan dipilih di antara banyak orang lain dan diproduksi dalam jumlah terbatas. eknik ini adalah tahap pertama dari sebagian besar percobaan rekayasa genetika: produksi perpustakaan DNA, PCR, DNA sequencing, et al.
Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri. Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.
Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 7).
Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi
Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik. E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium. Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).
Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning
Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda. Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 8).
Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.

‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9). Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA).



















Gambar 7.Kloning DNA dalam plasmid vektor




















Gambar 8.Pembentukan DNA library

Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vector.
Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library
Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang diinginkan. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization.
cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang, sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library, membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing. Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane. Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi yang sama dengan sel. Filter selajutnya diinkubasi dengan probe.

4.2. PCR (polymerase chain reaction)
PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan enzim Taq polimerase. PCR digunakan untuk mengamplifikasi bagian DNA yang pendek (sampai 10 kb). Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, teknik ini telah melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat bervariasi. Protokol dasar PCR adalah:
I. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga membentuj DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan.
II. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada temperature rendah. Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target.
III. Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim DNA polymerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru.
IV. Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus berulang.
Gambar 10 menunjukkan proses PCR. Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uv-transiluminator.



















Gambar 9.Pembentukan cDNA




















Gambar 10.Proses PCR